周一至周日 8:00-22:30(免远程费):
学术咨询:400-888-7501 订阅咨询:400-888-7502
征稿授权 运营授权
当时方位:中文期刊网 > 论文资料 > 自然科学 > 生物医学论文 > 正文
生物医学论文( 共有论文资料 28 篇 )
引荐期刊
抢手杂志

根据人源Cdc25C蛋白交融表达研讨

2013-06-26 14:31 来历:生物医学论文 人参加在线咨询

资料与办法

1.资料:MCF-7细胞由本试验室保存;感受态大肠杆菌DH5α、BL21及质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;DMEM培育基购自GIBCO生物公司;胎牛血清为杭州江滨公司产品;ImPro-II逆转录试剂盒购自Promega公司;限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自NEB公司;谷胱甘肽琼脂糖珠4B购自AmershamPharmaciaBiotechnology公司;辣根过氧化物酶符号的GST抗体、Cdc25C磷酸酶底物3-OMFP购自Sigma公司;引物组成和测序由北京奥科生物技能有限公司完结。

2.MCF-7细胞培育及总RNA提取:用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培育基,于37℃、5%CO2培育箱中培育MCF-7细胞。搜集MCF-7细胞,计数,在约5×106细胞中参加350μLRLT裂解液,充沛混匀后参加等体积的70%乙醇,混匀并转移至RNA吸附柱中,8000r/min离心15s,弃上清液;参加700μLRW1液,8000r/min离心15s,弃上清液;参加500μLRPE液,8000r/min离心15s,弃上清液,重复1次;将吸附柱转移到一个新的2mL的离心管中,较大转速离心1min后参加30~50μL不含RNase的水,较大转速离心1min后,将RNA洗脱至1.5mL的EP管中。

3.RT-PCR扩增cdc25c基因:选用ImPro-II逆转录试剂盒,取1μgRNA为模板,以oligo(dT)15和随机引物逆转录组成cDNA(反响条件:25℃5min,42℃1h)。70℃、15min灭活反响体系中的逆转录酶和RNase抑制剂。以该cDNA为模板,以正向特异性引物5'-GCGGGATCCATGTCTACGGAACTCTTCTCATC-3'(含BamHⅠ酶切位点)、反向引物5'-ATTCCGCTCGAGTCATGGGCTCATGTCCTTCACC-3('含XhoⅠ酶切位点)扩增cdc25c基因序列。将PCR扩增产品及载体pGEX-4T-1分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后衔接,转化大肠杆菌感受态DH5α,挑选阳性克隆进行酶切判定。

4.GST-Cdc25C蛋白的诱导表达:将pGEX-GST-Cdc25C质粒转化大肠杆菌感受态BL21,接种至氨苄西林抗性的LB培育基中,37℃、200r/min培育至D600nm为0.6~0.8,参加IPTG至终浓度为1mmol/L,12℃、200r/min培育6~8h,收成菌体,超声波低温破碎菌体,离心后取上清,参加4×SDS上样缓冲液[200mmol/LTris-HCl(pH6.8),8%SDS,4%溴酚蓝,40%甘油、10%β-巯基乙醇],沸水浴5min,将样品进行SDS-PAGE。

5.GST-Cdc25C蛋白的纯化:在菌体上清中参加谷胱甘肽(GSH)琼脂糖珠4B,4℃旋转孵育2h,1000r/min离心,弃上清,用PBS缓冲液洗3次,备用;分别向结合GST的GSH琼脂糖珠、与GST-Cdc25C结合的GSH琼脂糖珠中参加1×SDS上样缓冲液[50mmol/LTris-HCl(pH6.8),2%SDS,1%溴酚蓝,10%甘油、2.5%β-巯基乙醇],沸水浴5min,离心后取上清进行SDS-PAGE。

6.免疫印迹剖析:SDS-PAGE完毕后,将胶用半干转膜法转移到PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的PBST室温关闭1h,参加稀释的辣根过氧化物酶符号的GST抗体,室温孵育1h,用PBST洗膜3次,每次5min,较后将含有辣根过氧化物酶底物的ECL滴加到膜上,在暗室中进行X线胶片显影。

7.磷酸酶活性剖析:在300μL磷酸酶反响缓冲液[50mmol/LTris-HCl(pH8.0),50mmol/LNaCl,1.0mmol/LEDTA,5mmol/LDTT,0.1%BSA]平分别参加1μg纯化的GST蛋白和GST-Cdc25C蛋白,随后参加Cdc25C的磷酸酶底物3-OMFP(终浓度150μmol/L),37℃温育,用荧光分光分度计在490nm激起光波长、530nm发射光波利益检测反响产品的荧光强度,荧光强度值的添加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。

成果

GST-Cdc25C交融表达质粒的构建:为了取得cdc25c基因,咱们首要提取了MCF-7细胞总RNA,用RT-PCR逆转录取得MCF-7cDNA库,并用cdc25c特异性引物从cDNA库中扩增取得cdc25c基因,PCR产品电泳判定成果见图1。测序成果标明,该PCR产品序列与cdc25c基因序列(GenBankNo.BC019089)共同。随后,经过BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点将cdc25c基因的PCR产品克隆至pGEX-4T-1载体上,GST-Cdc25C交融表达阳性克隆双酶切判定成果如图1所示。

GST-Cdc25C交融蛋白的表达及纯化:用大肠杆菌BL21感受态细胞表达GST-Cdc25C交融蛋白,诱导表达条件为低温12℃、6~8h。搜集菌体,于15mL冰浴的PBST(含蛋白酶抑制剂1片/25mL)中超声波破碎4min,使可溶性GST-Cdc25C交融蛋白开释到上清液中。SDS-PAGE成果标明,与GST对照组比较,在相对分子质量约87×103方位呈现了明显条带(图2A),与GST-Cdc25C蛋白的相对分子质量共同,阐明GST-Cdc25C在大肠杆菌BL21中取得了可溶性表达。随后,用GSH琼脂糖珠与裂解上清混匀,4℃旋转孵育2h,离心得到纯化的相对分子质量为87×103的GST-Cdc25C交融蛋白,并存在必定程度的降解。免疫印迹试验进一步标明,GST-Cdc25C交融蛋白及GST对照蛋白均取得表达及纯化(图2B)。

GST-Cdc25C的磷酸酶活性剖析:以3-OMFP为Cdc25C磷酸酶反响底物,在磷酸酶活性反响体系平分别参加1μgGST和GST-Cdc25C交融表达蛋白,37℃温育,每隔5min用荧光分光分度计检测反响产品的荧光强度,荧光强度添加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。用荧光强度值相对时刻改变绘图,成果如图3,与GST蛋白比较,参加GST-Cdc25C交融蛋白的反响体系的荧光值明显升高且速率安稳(根本呈线性),阐明原核表达的GST-Cdc25C具有明显的安稳的磷酸酶活性。

评论

在成功钓取人源cdc25c全长基因的根底上,咱们表达纯化了具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C交融蛋白。因为GST-Cdc25C在表达进程中简单构成天然二硫键,易导致包容体的构成,且结构的不安稳添加,因而存在必定程度的降解。Cdc25C在调控细胞周期G2/M转化进程中有重要效果,其磷酸酶活性关于激活Cdc2/周期蛋白B复合体,敞开细胞有丝分裂进程至关重要。现在发现的Cdc25C上游调理分子首要经过相互效果及磷酸化或泛素化润饰调理Cdc25C的磷酸酶活性及亚细胞定位,从而影响细胞周期的进程。本研讨中,咱们表达纯化出具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C交融蛋白,为研讨c-Abl酪氨酸激酶经过Cdc25C调控G2/M转化的分子机理供给了根底。(本文图略)

本文作者:张鹏 刘萱 曹诚 单位:北京军事医学科学院 生物工程研讨所 

在线咨询
引荐期刊阅览悉数
.