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低聚糖对乳酸菌抗氧化钳制的影响研讨

2013-05-23 11:47 来历:养分学论文 人参加在线咨询

资料与办法

1.资料与仪器

保加利亚乳杆菌(L.bulgaricusFn009)本试验室保存;GOS、XOS本试验室供给;PI(碘化丙啶)sigama公司;DTNB(二硝基苯甲酸)sigama公司;H2O2、Vc(抗坏血酸钠)、FeSO47H2O、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、MTT(噻唑蓝)、二甲亚砜、柠檬酸三钠、叠氮钠、GSH(还原型谷胱甘肽)、偏磷酸等试剂均为国产剖析纯。总超氧化物酶歧化酶(T-SOD)试剂盒南京建成生物工程研讨所。Delta320pH计上海梅特勒-托利多仪器有限责任公司;FA1004A电子天平上海精天电子仪器有限公司;超级恒温水浴箱上海市化学仪器总厂;5804R型台式高速冷冻离心机德国艾本德生物技能有限公司;QL-901漩涡混匀器江苏海门其林医用仪器厂;MultiskanMk3酶标仪美国Thermo公司;立式主动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗仪器外表厂;超净工作台苏净集团安泰公司;FACSCalibur流式细胞仪美国BD公司;隔水式恒温培育箱上海市跃进医疗器械厂;微量分光光度计spectrophotometer上海琪特剖析仪器有限公司;7900HTfast实时荧光定量PCR仪美国ABI公司。

2.试验办法

1).乳酸菌活化:试验室甘油保存(-70℃)的乳酸菌接种到MRS琼脂培育基活化,挑取单菌落接种于MRS液体培育基深层培育过夜(18h,37℃)。2).乳酸菌耐H2O2才能的测定:收成培育至12h的乳酸菌菌体,运用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)清洗三次,从头悬浮在PBS中调整菌体浓度至107CFU/mL。取5mL菌悬液沸水浴15min,制备死菌悬浮液作为阴性对照组。按表1参加试剂,37℃孵育,每隔2h取100μL菌悬液参加96孔板,参加5mg/mL的MTT20μL,振动混匀37℃反响2h,参加100μL二甲亚砜混匀后测定OD570nm吸光度。3).FCM检测乳酸菌细胞膜完好性:乳酸菌在MRS培育基上发酵至对数中期,搜集菌体,调整浓度至106CFU/mL。试验分组及试剂增加次序同表1(H2O2终浓度:2mM;低聚糖终浓度为20mg/mL),置于37℃孵育2h后离心搜集沉积,参加PI溶液,终浓度为50μg/mL,冰浴避光染色30min,上流式细胞仪测定,在488nm激发光激发下,波长630nm处检测荧光信号。以相同浓度活菌悬液设“门”,FL2-H标明荧光强度,Counts标明细胞频数,M1标明细胞膜完好的细胞比率,M2标明细胞膜破损的细胞比率,每个样品搜集10000个细胞,用CellQuest软件进行数据剖析。4).乳酸菌抗氧化酶活测定:制造新鲜的MRS培育基记为H2O2组,以GOS和XOS别离替代20%葡萄糖的MRS培育基记为H2O2+GOS组和H2O2+XOS组;在MRS培育基中增加0.01%Vc记为H2O2+Vc组,别离接种1%乳酸菌,培育3h后,增加H2O2(终浓度:2mM)树立氧化应激模型,以不增加H2O2的MRS为正常组。发酵至对数中期,4800r/min离心10min,搜集菌体,用PBS清洗三次,调整菌体浓度为108CFU/mL,300W冰浴超声破碎10min,破碎液10000r/min离心10min,搜集上清,即为无细胞提取物。依照T-SOD试剂盒阐明书测定乳酸菌无细胞提取物超氧化物歧化酶生机(U/mgprot),运用DTNB直接显色法[7]测定无细胞提取物的GSH-Px酶生机(U/mgprot),蛋白浓度选用考马斯亮蓝法[8]进行测定。5).乳酸菌应激蛋白基因表达的测定:搜集1.2.4氧化应激模型中发酵至对数中期的乳酸菌菌体,运用121℃灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)水洗刷三次,4800r/min离心10min,搜集菌体,提取RNA。运用荧光定量PCR技能检测氧化应激状态下低聚糖对三株乳酸菌抗氧化钳制基因和通用应激蛋白基因表达水平的影响。本试验所选相关基因的引物由上海捷瑞公司规划并组成,引物序列见表2。6).数据处理与统计剖析运用:SPSS17.0软件进行单因素方差剖析、用Turky法进行多重比较和差异明显性查验,成果以平均数标准偏差(XSD)标明。

成果与剖析

1.低聚糖对乳酸菌反抗H2O2才能的影响:过氧化氢是研讨氧化钳制的常用介质,乳酸菌对H2O2具有较高的敏感性,近期研讨发现,保加利亚乳杆菌极易遭受H2O2或其他活性氧(ROS)进犯,构成氧化损害,形成成长阻滞乃至逝世[9-10]。图1显现,乳酸菌在H2O2钳制下,活菌率不断下降,H2O2孵育8h后活菌率下降至20%左右。GOS和XOS干涉6h后乳酸菌活菌率明显高于相同时刻点的H2O2组(p<0.05),但仍明显低于正常组(p<0.05)。阐明GOS和XOS可以增强乳酸菌对H2O2钳制的抗逆性,进步氧化钳制条件下的存活率。

2.氧化钳制条件下低聚糖对乳酸菌细胞膜完好性的影响:乳酸菌遭受氧化钳制时,细胞膜上的蛋白质、脂类等容易发生氧化损害,细胞膜的完好性和功能性遭到损坏,较终导致菌体逝世。图2显现,正常组菌体细胞膜完好率为98%,死菌悬液设置的阴性对照组细胞膜破损比率为97%,H2O2组乳酸菌PI染色率高达79%,细胞膜完好菌体的比率仅为17%,阐明H2O2钳制可以形成乳酸菌细胞膜氧化损害,细胞完好性受到损坏。GOS和XOS干涉组,乳酸菌细胞膜完好率别离为34%和30%,较H2O2组别离进步了17%和13%。从以上数据可以看出,GOS和XOS干涉可以削弱H2O2对乳酸菌细胞膜的氧化损害程度,对菌体细胞膜具有维护效应。

3.氧化钳制条件下低聚糖对乳酸菌抗氧化酶生机影响图:3标明,H2O2组乳酸菌的谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)生机较正常组明显下降(p<0.05),阐明H2O2钳制可以形成乳酸菌抗氧化酶生机的明显下降(p<0.05)。GOS和XOS干涉后乳酸菌GSH-Px生机较H2O2组均有所升高,但XOS干涉组差异不明显(p>0.05),两者仍低于Vc干涉组和正常组;GOS和XOS干涉后乳酸菌的T-SOD生机较H2O2组明显升高,但仍明显低于Vc干涉组和正常组(p<0.05)。阐明氧化钳制条件下,GOS和XOS干涉可以进步乳酸菌的抗氧化酶生机,但低聚糖效果效果低于Vc。
2.4H2O2钳制下低聚糖对乳酸菌应激蛋白基因表达水平的影响:乳酸菌在遭受环境钳制(如极点温度、pH、渗透压、氧和饥饿等)时,会发动相应的应激感应体系和应激防护体系,诱导相关基因进行调理[11],发生应激维护效果,这些应激反响可以进步乳酸菌在环境钳制下的存活才能。对乳酸菌的蛋白质组学研讨标明,乳酸菌在环境钳制时可以诱导发生多种应激蛋白,其间Dnak、GroEL和Gsp65伴侣蛋白可以被多种钳制条件所诱导[12-13],归于通用应激蛋白,可以参加DNA和蛋白质修正。损害修正是反抗氧化和其他钳制的根本机制[14]。图4标明,在H2O2钳制条件下,乳酸菌的应激蛋白基因表达量较正常组明显进步(p<0.05),其间,Dnak热激蛋白基因表达量上调近80倍,GroEL和Gsp65应激蛋白基因表达量别离上调了20倍和13.3倍,阐明H2O2钳制可以导致乳酸菌应激蛋白基因明显上调(p<0.05)。GOS和XOS干涉后三种应激蛋白基因的表达量较H2O2组明显下降(p<0.05),但仍明显高于正常组(p<0.05),阐明GOS和XOS可以削弱H2O2对乳酸菌的氧化钳制程度,下降乳酸菌的氧化应激反响。

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